Klorofil je zeleni pigment koji se nalazi u višim biljkama i svim drugim fotosintetičkim organizmima. Klorofil A i hlorofil B su rastvorljivi u etanolu, eteru i acetonu i drugim rastvaračima, nerastvorljivi u vodi i petroleteru, stoga se mogu koristiti polarna rastvarača kao što su aceton, metanol, etanol, etil acetat i tako dalje za ekstrakciju hlorofila.
Proces ekstrakcije hlorofila:
Ekstrakcija hlorofila se priprema u polumračnoj prostoriji na 25 stepeni C. Koraci ekstrakcije su sljedeći:
(1) Uzmite 1000 grama svježih zelenih listova i zgnječite ih u Wechsleru.
(2) Stavite zgnječenih 1000 grama zelenog lišća u aceton sa malom količinom kalcijum karbonata (temperatura 20 stepeni) za ekstrakciju, sve dok fragmenti lista ne postanu bezbojni nakon filtriranja i čišćenja.
(3) Filtrirani acetonski ekstrakt stavite u lijevak koji sadrži 1 litar petrolej etera i 100 mL acetona, a zatim lagano rotirajte uz dodavanje destilovane vode dok se ne rasloji. Većina acetona i nečistoća rastvorljivih u vodi u sloju vode se odbacuje, ostavljajući samo rastvor petrolej etera.
(4) Nakon što se otopina petrolej etra ponovo prečisti destilovanom vodom, očisti se više od 5 puta sa 200 ml 80 postotnog rastvora metanola koji sadrži petroleter i 0,01 g oksalne kiseline i na kraju se dobije žuto-zelena suspenzija .
(5) Osušite suspenziju bezvodnim natrijum sulfatom i infiltrirajte je u kolonu napravljenu od praha saharoze debljine 3 cm. Zatim očistite istaložene pigmente kako biste uklonili karotenoide i učinili da sadrže samo prirodni hlorofil.
(6) Kolona saharoze koja sadrži prirodni hlorofil je podijeljena u dva sloja, zeleni sloj ima 4-10mm sloj hlorofila B, drugi plavi sloj je 2-6 mm sloj hlorofila A.
(7) Dio koji se nalazi u sredini plavog sloja (oko polovina plavog sloja) stavlja se u etar, suspenzija se filtrira i ekstrahuje, očisti destilovanom vodom, osuši natrijum sulfatom i filtrira pomoću pribora da se dobije hlorofil. A.
(8) Uklonite srednji dio zelenog sloja u (6) i brzo ga stavite u eter radi filtriranja i ispiranja da se dobije otopina hlorofila B etera.
Kako razdvojiti tokom vađenja?
Kromatografija je važna metoda za odvajanje, prečišćavanje i identifikaciju organskih spojeva, posebno u mikroanalizi ima široku primjenu. Pigmenti u voću i povrću uglavnom uključuju karoten rastvorljiv u mastima, lutein, hlorofil i antocijanin rastvorljiv u vodi. U eksperimentima ekstrakcije, možemo koristiti princip slične mešljivosti, filtriranje u vodi rastvorljivom antocijaninu, što zauzvrat može koristiti tankoslojnu hromatografiju, kolonsku hromatografiju, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC) za odvajanje beta-karotena, luteina i hlorofil, oslabljen zbog polariteta tri vrste pigmenta zauzvrat, može se na odgovarajući način odabrati jedan organski rastvarač ili različit omjer miješanog rastvarača kao ekspanzionog agensa i agensa za eluiranje. Određeni su optimalni uvjeti odvajanja.
